新一代Nanoimager可轻松实现超分辨荧光成像,中国

日期:2019-11-03编辑作者:彩世界平台

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中国化工仪器网 行业动态】近年来,随着活细胞体系单分子荧光成像技术的发展,膜蛋白单分子研究,特别是受体动力学的研究,已成为目前单分子研究领域中活跃的研究方向之一。近几年发展起来的超分辨成像技术因其能够突破光学衍射极限,而比传统光学显微镜具有更高的分辨率和更高的定位精度。 英国Oxford Nanoimaging公司新推出的超分辨荧光显微镜—Nanoimager,由牛津大学Achillefs Kapanidis教授团队经过8年时间研发而成,是全球台大视野单分子FRET显微镜,将以超强的分辨率在单分子示踪、活细胞成像、蛋白互作、3D成像等研究领域发挥重要作用。 Nanoimager主要技术特点 横向分辨率<20nm;纵向分辨率<50nm 稳 定 性:<1 μm/K的漂移;<1 nm (1 Hz to 500 Hz)振幅 支持同时双色成像和顺序四色成像 采用1级激光,使用安全 Nanoimager采用PALM/dSTORM技术和光激活定位显微技术 ,利用单分子定位算法并结合光学系统艾里斑的形状,以超高精度获得荧光分子的中心位置,然后用CCD将其信号进行采集转化终得到分辨率为20nm的超分辨图像。 Nanoimager主要应用案例 1、单分子FRET FRET是一种两个荧光分子间非辐射性的能量转移方式,反映两者的分子间距(一般在2 – 10 nm的间距发生)。Nanoimager是世界台用于大视野单分子荧光共振能量转移的商业化仪器,其适用于smFRET的关键功能包括:同时双色成像;单分子散射光强度和总体平均的实时分析;视野中数千个单分子的高通量成像,以及用交替荧光激发 smFRET的功能来定量化学计量与FRET效率。图2是smFRET用于研究单个DNA霍利迪交叉的动力学。 2、单分子示踪 Nanoimager可以在两个通道同时示踪细胞或者纯化物样品中的单分子 ,并计算扩散系数。细胞中分子的扩散系数可以被示踪,如酶或蛋白可以通过药物和抗生素的反应来示踪。低扩散率可以表示标记分子与另一分子或结构的相互作用或相结合。 Nanoimager可以直接反映纯化样品中荧光粒子的扩散率和预估大小,具有敏感性 和特异性 (双色标记可以显著降低检测杂质的可能性)。 3、更大视野的成像 Nanoimager的每个成像通道均有50 μm x 80 μm的大视野,且照明均匀,可以实现单分子或细胞的高通量成像并快速收集数据。图4显示了以10倍于其他技术的速度对突变的大肠杆菌细胞的不同表型进行成像。为了获得不同表型的可靠的结果,需要对大量细胞进行比较。使用具有大视野,能够自动对焦和自动获取数据的Nanoimager可以显著加快整个实验速度和通量。将大视野与超分辨成像结合是Nanoimager的独特优势。 编辑点评 超分辨荧光成像特指分辨率打破了光学显微镜分辨率极限的显微镜,技术原理主要有受激发射损耗显微镜技术和光激活定位显微镜技术。超分辨荧光显微镜以其独特的优势,已成为生物医学研究的重要工具。 (原标题:突破传统光学衍射极限:新一代Nanoimager可轻松实现超分辨荧光成像)

2019年9月9日,中国科学院生物物理研究所徐涛院士领衔的生命科学仪器研制中心团队在Nature Methods杂志发表了题为“Molecular resolution imaging by repetitive opticalselective exposure”的论文,提出了一种基于干涉定位成像的新技术,并据此研制出新型的ROSE单分子干涉定位显微镜,可以分辨点距为5 nm的DNA origami结构,把显微镜的分辨率提升到3 nm以内的分子尺度,单分子定位精度接近1 nm。

ROSE采用6个不同方向和相位的干涉条纹去激发荧光分子,荧光分子的发光强度与其所处条纹的相位相关,因此可以通过荧光分子强度与干涉条纹的相位关系来判断荧光分子的精确位置信息。该方法可类比于GPS定位,GPS定位即是通过几颗卫星到GPS信号源的距离来判断信号源的精确位置。这种方法的理论定位精度是传统方法的2.4倍。

图1 左侧,传统质心拟合定位方法,右侧,利用干涉条纹定位的ROSE方法

由于单分子发光时存在的闪烁以及漂白会对亮度产生影响,ROSE技术对干涉条纹切换速度和成像数据读出速度都提出了巨大的挑战。团队创造性的设计了基于电光调制器的干涉条纹快速切换激发光路,以及基于谐振振镜扫描的6组共轭成像光路,二者的同步实现了高达8 kHz的分时成像,确保在相机的单次曝光时间里把每个单分子发光状态均匀分配给6个干涉条纹,避免了荧光分子发光能力波动对定位精度的干扰。

通过设计不同荧光位点间距的DNA origami阵列,团队把该技术与传统的质心拟合方法进行了全面对比,发现在相同光子数条件下该技术能清晰解析20 nm和 10 nm的阵列结构,而传统方法只能解析20 nm阵列。团队进一步验证了该技术可以解析5 nm的阵列,证明该技术已经达到了分子水平的分辨率。单分子定位数据表明该技术已经实现接近1 nm的定位精度。

图2 不同荧光位点间距的DNA origami成像,ROSE技术与传统的质心拟合方法进行对比验证,scale bars,上50 nm,下25 nm。

利用ROSE技术,团队还对细胞纳米结构进行了解析,并与传统的定位技术做了对比。结果显示ROSE在解析免疫标记的微管空心状结构、CCP的空心状结构以及较致密的细胞骨架等细胞精细结构更具优势。

图3 鬼笔环肽标记的微丝成像,ROSE技术与传统的质心拟合方法进行对比验证,scale bars,上1 µm,下500 nm。

中国科学院生物物理研究所仪器研制中心团队近年来一直聚焦于显微成像仪器设备和技术方法的开发。团队先后研制了偏振单分子干涉成像、冷冻单分子定位成像以及超分辨光电融合成像系统。利用这些新型仪器设备开发了新的超分辨显微成像算法、探针和技术,并广泛应用于细胞生物学研究,支撑团队和合作者在该领域取得了系统性成果产出,并申请多项专利。

所谓“所见即所得”,ROSE显微镜为生命科学的研究提供了更强有力的观察手段,具有广泛的应用前景,非常适合于细胞纳米结构的解析与高精度分子定位的研究,其接近1 nm的定位精度也可满足部分生物大分子内部结构解析和动态变化的研究。我们期待该技术的持续发展,开发出具有更高时空间分辨率的超分辨成像方法,进一步推进光学显微镜分辨率的极限。

研究背景

显微镜是人类最伟大的发明之一,自17世纪列文虎克把显微镜应用于微生物研究以来,人们就一直孜孜不倦的追求显微镜分辨率的提高,以期待看到更微小的细胞结构,了解生命活动的本质。但由于光学显微镜分辨率受衍射现象限制,在进入本世纪前一直没有取得突破。

进入21世纪以来多种超高分辨率荧光成像技术被提出,新型超高分辨率显微镜产品也如雨后春笋般出现,打破了光学分辨率的极限, 将光学分辨率提高到几十纳米的尺度, 可以用来观察精细的亚细胞结构和生物分子定位信息,被广泛地应用于生物学研究中,相关工作也因此获得了2014年的诺贝尔化学奖。但把光学显微镜分辨率进一步提高到分子水平,以观察纳米尺度的亚细胞结构乃至单个生物大分子内的结构仍是巨大的挑战。

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